Análise das regiões polimórficas do gene HASPB (K26) de Leishmania infantum em amostras clínicas positivas para leishmaniose visceral e coinfecção LV/HIV

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença grave que afeta a população de vários países, onde o Brasil apresenta a maior prevalência da infecção nas Américas. Com o estudo do gene codificante da proteína B de superfície (HASPB ou K26) de Leishmania infantum é possível identificar as variações polimórficas intraespecíficas e, assim, será possível consolidar a descrição de um perfil polimórfico presente no Estado de Pernambuco. O objetivo do trabalho foi analisar as regiões polimórficas do gene HASPB (K26) de Leishmania infantum em amostras clínicas positivas para leishmaniose visceral e coinfecção LV/HIV. O sistema K26 PCR foi otimizado utilizando concentrações variadas de DNA genômico de L. infantum. Foi realizado o screening de amostras clínicas de DNA através de dois sistemas de PCR simples, kDNA e ITS1/RFLP, para ensaios posteriores com a K26 PCR nas amostras positivas. A curva de dissociação de alta definição (qPCR-HRM) foi empregada na localização de temperaturas de melting específicas para L. infantum. Os amplicons do gene K26 foram sequenciados e alinhados as sequencias selecionadas em base de dados. A K26 PCR apresentou limiar de detecção de 1 pg para amplicon de 700 pb. A especificidade dos primers foi avaliada experimentalmente e in silico, apresentando anelamento inespecífico com DNA humano. Em paralelo, foram selecionadas 78 amostras de DNA através dos dois sistemas screening, sendo 17 caracterizadas como L. infantum. Os ensaios com DNA das amostras clínicas para o sistema K26 PCR revelaram bandas espúrias. A análise através qPCR-HRM em DNA genômico do parasita resultou em amplificação com Tm de 88,2 °C, já o ensaio com amostra clínica revelou duas amplificações com distintas temperaturas de melting, 84,6 e 88,2 °C. Três amplicons do gene K26 foram sequenciados e alinhados a cinco sequencias da base de dados, indicando 38,2 % de similaridade. Pode-se concluir que o sistema K26 PCR é recomendável para análise dos polimorfismos genéticos, contanto que o DNA seja extraído diretamente de espécies isoladas em meio de cultura.

Caracterização de interações entre subunidades do complexo de iniciação da tradução EIF4F e homólogos da proteína de ligação ao poli-A (PABP) de Leishmania sp

Os tripanossomatídeos são caracterizados por processos moleculares diferenciados como a transcrição policistrônica e regulação pós-transcricional da expressão gênica. Em mamíferos, a tradução se inicia com a ligação do complexo eIF4F (formado pelos eIF4A, eIF4E e eIF4G) a extremidade 5' dos mRNAs, o que facilita seu reconhecimento pelo ribossomo. A atividade do eIF4F é reforçada pela proteína de ligação a cauda poli-A (PABP), na extremidade 3' dos mRNAs, que interage com o eIF4G. Dois complexos do tipo eIF4F foram identificados em tripanossomatídeos: o primeiro formado pelos EIF4G3, EIF4E4 e EIF4AI com a PABP1; e um outro baseado na interação do EIF4G4 com o EIF4E3 e o EIF4A1. Este trabalho buscou caracterizar as interações entre as subunidades destes complexos e sua associação com PABPs de Leishmania, avaliando o efeito de mutações em motivos específicos. Proteínas recombinantes foram geradas fusionadas a GST e avaliadas quanto a sua habilidade de interagir com parceiros marcados radioativamente em ensaios do tipo pull-down. Para o EIF4G3, mutações individuais em dois resíduos vizinhos (I8A e R9A), afetaram a interação com o EIF4E4 e a mutação de ambos os resíduos equivalentes do EIF4G4 (IL25-26AA) também impediu sua ligação ao EIF4E3, sugerindo um motivo comum para a ligação aos seus parceiros. As proteínas EIF4E3 e EIF4E4 foram avaliadas quanto à capacidade de interagir com a PABP2 e PABP1 respectivamente, e mutações em motivos conservados nas regiões N-terminais dos EIF4E (Boxes A, B e C) aboliram sua interação com os homólogos da PABP. Para identificar que regiões da PABP1 estão relacionadas às interações com o parceiro EIF4E4, foram obtidas proteínas PABP1 mutantes em motivos conservados e observou-se que a mutação no motivo TGM, C-terminal, aboliu sua interação com o EIF4E4. Com estas abordagens conseguiu-se avançar na definição das interações entre as referidas subunidades do eIF4F e PABP, identificando-se diferenças relevantes em relação a outros eucariotos

Identificação de motivos relevantes para a função do fator de iniciação da tradução EIF4E3 de Leishmania sp

Os tripanossomatídeos são organismos caracterizados pelo controle póstranscricional da expressão gênica, principalmente em nível de tradução. Na tradução em eucariotos, tem grande destaque o complexo eIF4F, sendo um de seus principais componentes o fator de iniciação da tradução eIF4E. Já foram descritos em tripanossomatídeos seis homólogos para o eIF4E, nomeados EIF4E1 a 6. Em um estudo com Leishmania amazonensis, focado no EIF4E3, percebeu-se que seu perfil de expressão se alterava rapidamente numa curva de crescimento, com este apresentando ao menos duas bandas. As mudanças observadas sugeriam modificações pós-traducionais do tipo fosforilação, algo posteriormente confirmado. Analisando-se a sequência do EIF4E3 de Leishmania, foi possível identificar a presença de possíveis sítios de fosforilação e de ligação a parceiros funcionais como homólogos do eIF4G, outro componente do complexo eIF4F, e da proteína de ligação á cauda poli-A (PABP). No presente estudo foi analisado o perfil de expressão e a capacidade de ligação a parceiros funcionais do EIF4E3 de Leishmania superexpresso em células transfectadas e no qual foram introduzidas mutações em motivos específicos. Os resultados mostraram um perfil de expressão de ao menos três bandas para o EIF4E3 de L. amazonensis e duas para L. infantum, com o sítio S75, presente apenas na primeira, sendo o responsável por esta diferença. Em ensaios de imunoprecipitação, foi identificado um motivo que, quando mutado, aboliu a ligação do EIF4E3 com a PABP3, sugerindo este como o sítio de interação entre os fatores. Com a análise do efeito de mutações no EIF4E3 de L. amazonensis, foi percebido que ao se mutar três motivos implicados na à PABP e o possível sítio de ligação ao EIF4G, sua fosforilação diminuiu drasticamente, sugerindo a necessidade destas interações para que a fosforilação ocorra. Estes resultados indicam um complexo mecanismo de modificações pós-traducionais responsáveis pela regulação do EIF4E3 e contribuem a para a caracterização da sua função em Leishmania

Análise da expressão heteróloga de protéinas com domínios de ligação a RNA em Leishmania infantum

Os tripanossomatídeos possuem uma combinação não usual de mecanismos moleculares, e seus processos de regulação de expressão gênica ocorreram a nível pós-transcricional. Acredita-se que essa regulação envolva tanto o controle da estabilidade dos mRNAs, como sua tradução em proteínas, eventos em que atua a proteína de ligação à cauda poli-A (PABP - Poly-A Binding Protein), uma das principais proteínas de ligação a RNAs em eucariotos. Um grande número destas proteínas está presente nos tripanosomatídeos, se caracterizando por possuírem domínios típicos de ligação a RNA, como o domínio RRM (RNA Recognition Motif). Dentre estas se destacam as proteínas de ligação a sequências ricas em uridina (UBPs), que se mostraram capazes de interagir com homólogos de PABP. Outras proteínas hipotéticas contendo domínios de ligação a RNA foram identificadas em ensaios que buscavam parceiros diferenciais para os três homólogos de PABP de Leishmania. Este trabalho se propôs a contribuir na caracterização funcional das proteínas UBPs e das proteínas hipotéticas, através da otimização de sua expressão de forma heteróloga em L. infantum, fusionadas ao epítopo HA. Para isto, os genes codificantes dos três homólogos de UBPs, e de cinco outras proteínas de ligação a RNA que parecem interagir com PABPs, foram amplificados e clonados em vetor de expressão de Leishmania. As construções geradas foram transfectadas em L. infantum e a expressão de seis destas proteínas avaliada. Os resultados obtidos mostram uma variação no reconhecimento das proteínas geradas com anticorpos comerciais anti-HA, que parecem depender da sequência de aminoácidos da sua extremidade C-terminal. Diferenças significativas nos seus níveis de expressão também foram observadas. Entre os três homólogos de UBP, dois destes se mostraram mais abundantes enquanto que os três são representados por mais de uma banda, indicando possíveis modificações pós-traducionais

Avaliação da relevância da gp63 de Leishmania braziliensis e Leishmania infantum na interação com o hospedeiro invertebrado

A gp63, metalopeptidase altamente abundante na superfície de Leishmania, contribui para uma infinidade de funções bem estabelecidas na interação deste parasito com o hospedeiro mamífero. No entanto, apesar desta molécula ser abundantemente expressa na superfície das formas promastigotas, encontradas no inseto vetor, pouco é conhecido sobre as funções desempenhadas por essa metalopeptidase no flebotomíneo. Nosso grupo de pesquisa, utilizando abordagens bioquímicas, tem demonstrado que moléculas de gp63 de vários tripanosomatídeos não patogênicos ao homem estão implicadas na adesão ao intestino de insetos hospedeiros. Aqui, nós analisamos o papel da gp63 na interação de Leishmania braziliensis e Leishmania infantum, com os seus respectivos insetos hospedeiros, Lutzomyia intermedia e Lu. longipalpis e com a linhagem celular derivada de Lu. longipalpis (LL5). Os intestinos dissecados de insetos foram prétratados ou não com o fosfoglicano (PG) puro derivado do lipofosfoglicano e colocados para interagir com os parasitos. Em paralelo, promastigotas de L. braziliensis e L. infantum foram pré-tratados com anticorpo anti-gp63 ou com inibidores da metalopeptidase. Depois disso, os parasitos foram colocados para interagir com os intestinos dissecados de insetos ou com as células LL5 Como esperado, o PG praticamente elimina a capacidade dos parasitos de se ligarem ao intestino dos insetos. Todos os tratamentos relacionados com a gp63 também provocaram uma diminuição acentuada nestes ensaios de ligação. Além disso, o sobrenadante de cultura de L. braziliensis foi concentrado por precipitação com sulfato de amônio e analisado por SDS-PAGE e SDS-PAGE-gelatina. Observamos uma degradação proteolítica, por volta de 63 kDa, que corresponde à enzima gp63 já identificada e caracterizada em várias espécies de Leishmania. Esses resultados em conjunto demonstram uma possível participação da gp63 na interação com o inseto vetor e nos estimulam a continuar estudando o papel dessa metalopeptidase no ciclo de vida de Leishmania

Avaliação citopatológica da medula óssea e perfil hematológico de cães naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) chagasiCarla de Oliveira Honse

Foram avaliados quarenta e um cães adultos, machos e fêmeas, sem raça definida, provenientes de inquéritos sorológicos para leishmaniose visceral canina realizados pela Secretaria Municipal de Saúde do Rio de Janeiro. O objetivo deste estudo foi descrever as alterações citopatológicas da medula óssea e o perfil hematológico de cães naturalmente infectados por Leishmania (Leishmania) chagasi. A avaliação citológica da medula óssea incluiu a análise qualitativa e quantitativa. O perfil hematológico foi avaliado através de contador automático de células e esfregaços sanguíneos. Adicionalmente, foram realizadas a imunofenotipagem de linfócitos medulares, pesquisa de formas amastigotas na medula óssea e avaliação dos estoques de ferro medular. De acordo com os resultados obtidos, cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi apresentaram hiperplasia das séries mieloide, linfoide e monocítica, onde frequentemente foram observadas formas amastigotas, anemia normocítica normocrômica e aumento dos estoques de ferro medular Não foram observadas diferenças estatisticamente significativas entre as populações de linfócitos T e linfócitos B medulares. Em conclusão, os cães naturalmente infectados por L. (L.) chagasi apresentaram alterações na medula óssea e no perfil hematológico independentemente da manifestação clínica apresentada pelo animal. Hiperplasia das linhagens hematopoiéticas, anemia, eritrofagocitose e aumento dos estoques de ferro medular possibilitaram uma melhor compreensão dos mecanismos fisiopatológicos envolvidos na doença e a pesquisa de formas amastigotas na medula óssea contribuiu como uma importante ferramenta diagnóstica da leishmaniose visceral canina

Estudo clínico-molecular na Leishmaniose mucocutânea diagnóstico e rastreamento de subpopulações de Leishmania (Viannia) braziliensis nos níveis inter e intrapacientes

O presente estudo teve como principal objetivo avaliar a diversidade genética de Leishmania (Viannia) braziliensis nos níveis inter e intrapacientes, diretamente em lesões cutâneas e mucosas de indivíduos com leishmanioses mucocutânea (LMC), disseminada (LD) e mucosa (LM), incluindo indivíduos coinfectados pelo vírus da imunodeficiência humana (HIV). Um total de 61 amostras procedentes de 38 pacientes foi analisado pelas técnicas da reação em cadeia da polimerase (PCR), da reação em cadeia da polimerase com primer único em condições de baixa estringência (LSSP-PCR) e da análise fenética, tendo como alvo molecular a região variável do minicírculo do DNA do cinetoplasto (kDNA). Neste estudo, predominaram indivíduos do sexo masculino e com acometimento mucoso nasal. A presença de DNA do parasita foi evidenciada pela banda diagnóstica de 750 pb, em todas as amostras analisadas, possibilitando o diagnóstico específico. Na investigação do perfil genotípico de subpopulações de L. (V.) braziliensis, através da LSSP-PCR, foi revelado o polimorfismo genético intrafragmento traduzido como uma assinatura do kDNA do parasito para cada amostra. Assinaturas de kDNAs similares em amostras de paciente coletadas ao mesmo tempo (mucosa oral e nasal), e a divergência nos perfis genéticos em amostras coletadas em tempos diferentes na mesma localização (mucosa nasal) sugerem a clonalidade do inóculo inicial, como consequência da estrutura populacional clonal de Leishmania No estudo da variabilidade genética de L. (V.) braziliensis nos níveis inter e intrapacientes foram evidenciadas similaridades genotípicas entre as amostras de lesões cutânea e mucosa intrapacientes. As análises fenética e estatística possibilitaram afirmar que a diversidade genética no nível intrapacientes é menor do que a observada entre os pacientes. Nenhuma associação pode ser observada entre os perfis genéticos de L. (V.) braziliensis e as formas clínicas da doença (LM, LMC, LD), e nem em relação à localização da lesão cutânea ou mucosa (nasal ou oral). O polimorfismo genético de L. (V.) braziliensis também foi evidenciado nos pacientes coinfectados pelo HIV, cuja análise fenética reuniu os perfis genéticos em dois grupos distintos, os quais discriminaram entre as amostras obtidas de pacientes com coinfecção Leishmania/ HIV daquelas obtidas de pacientes não coinfectados. A discriminação de perfis genéticos diferenciados de L. (V.) braziliensis em pacientes coinfectados pelo HIV sugere que a imunossupressão tem impacto na estrutura populacional do parasita. Os nossos resultados corroboram a complexidade genética existente nos parasitos do gênero Leishmania, reforçando a diversidade na dinâmica populacional e na plasticidade genética de L. (V.) braziliensis

Diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana utilizando a saliva coletada com swab

As leishmanioses caracterizam-se por um espectro de doenças distribuídas endemicamente em regiões tropicais e subtropicais do mundo. A obtenção de material biológico para análise diagnóstica apresenta cuidados cruciais ao paciente, por se tratar de um processo invasivo, passível de inflamação, e podendo haver reativação da doença, em alguns casos. Diante do avanço das técnicas moleculares e da utilização de alguns fluidos biológicos para o diagnóstico da Leishmaniose Tegumentar Americana (LTA), cogitou-se a possibilidade da identificação de DNA de Leishmania spp. em saliva através do método de coleta de swab, sendo contribuinte para o avanço no diagnóstico laboratorial. Assim, o propósito do estudo foi a identificação de DNA de Leishmania spp. a partir do diagnóstico molecular. Foram incluídos no estudo os pacientes que apresentaram lesões ativas, diagnósticos clínicos para LTA, antecedentes epidemiológicos compatíveis e não possuíam lesões cutâneo mucosas. O diagnóstico laboratorial envolveu a abordagem parasitológica através da pesquisa direta do parasito em amostras escarificadas de lesões, enquanto que o molecular compreendeu a extração do DNA das amostras de biópsia e swab salivar, seguidas da reação de PCR convencional (cPCR) e PCR em tempo real (qPCR). Foram investigados 40 pacientes com LTA havendo ocorrência de DNA do parasito em 10 amostras de saliva com cPCR, e 36 amostras utilizando qPCR. Em 28 amostras de biópsias também foi possível a detecção do DNA de Leishmania spp. e em 35 amostras de escarificado de lesão foram encontradas formas amastigotas do parasito, através de pesquisa direta. Na comparação entre os métodos propostos, a biópsia apresentou uma média de 50 por cento de compatibilidade em relação a cPCR e 67,5 por cento para a qPCR. A análise comparativa observou entre o diagnóstico parasitológico e os diagnósticos moleculares uma concordância de 32,5 por cento (14/40) em relação a cPCR, enquanto que a qPCR obteve 75,5 por cento (31/40) de concordância. Considerando a sensibilidade das técnicas de PCR utilizadas e o procedimento de coleta, através de swab advindo de fluidos salivares, os resultados demonstram a viabilidade do método de coleta de Leishmania spp. como uma nova abordagem diagnóstica auxiliar para a LTA, com benefícios à saúde do paciente

PCR em tempo real para caracterização de fontes alimentares de flebotomíneos (Diptera: Psychodidae)

Os flebotomíneos são insetos hematófagos de grande importância médica e veterinária atuando como vetores de parasitas como Leishmania. O estudo do padrão alimentar desses vetores pode ajudar a compreender a sua interação com potenciais reservatórios de Leishmania. Neste estudo, desenvolvemos ensaios de PCR em tempo real para identificação de sangue em flebotomíneos. Seis pares de primers foram desenhados com base no gene citocromo b de sequencias disponíveis no GenBank dos seguintes hospedeiros potenciais: cão, gato, cavalo, galinha, rato e humano. Primeiramente, os ensaios de PCR em tempo real utilizando SYBR Green foram conduzidos usando uma curva padrão com oito concentrações diferentes (i.e., 10 ng, 1 ng, 100 pg, 10 pg, 1 pg, 100 fg, 10 fg e 1 fg por 2 µl) de amostras do DNA extraído do sangue com EDTA a partir de cada espécie de animal. Em seguida, o DNA foi extraído de 100 fêmeas de flebotomíneos ingurgitadas de campo pertencentes a três espécies (i.e., Lutzomyia longipalpis, L. migonei e L. lenti) foram testadas pelos protocolos aqui padronizados. Fêmeas de flebotomíneos foram experimentalmente alimentadas em um rato (Rattus rattus) e utilizadas para avaliar a detecção do ensaio. Os protocolos funcionaram de forma eficiente com limites de detecção de 10 pg a 100 fg. Fêmeas de flebotomíneos ingurgitadas coletadas no campo estavam alimentadas de humanos (73 por cento), galinhas (23 por cento), cães (22 por cento), cavalos (15 por cento), ratos (11 por cento) e gatos (2 por cento). Curiosamente, 76,1 por cento das fêmeas de L. longipalpis foram positivas para o sangue humano. No total, 48 por cento das fêmeas testadas estavam alimentadas em uma única fonte, 31 por cento em duas e 12 por cento em três. A análise do curso de tempo mostrou que a técnica de PCR em tempo real visando o DNA de roedor foi capaz de detectar pequenas quantidades de DNA do hospedeiro até 5 dias após o repasto sanguíneo. Esses protocolos representam ferramentas promissoras para a identificação da fonte alimentar de flebotomíneos de campo

Estratégias para o aprimoramento do diagnóstico molecular na leishmaniose visceral

A leishmaniose visceral (LV) é uma doença infecto-parasitária causada por protozoários do gênero Leishmania. O trabalho teve como objetivo avaliar estratégias para o aprimoramento do diagnóstico molecular na LV, que compreenderam a avaliação da eficiência de diferentes métodos de extração de DNA em amostras de urina; a análise do uso da Reação em Cadeia da Polimerase quantitativa em tempo real (qPCR) como ferramenta para a detecção do DNA de Leishmania infantum na referida amostra; e a padronização de uma reação duplex qPCR para a detecção simultânea do DNA de L. infantum e do gene G3PD (controle endógeno). Depois da escolha do protocolo de extração de DNA mais apropriado, e após a otimização e a análise de reprodutibilidade, uma qPCR em urina foi padronizada. Em paralelo, após o desenho e a síntese de sondas TaqMan® compatíveis com os sistemas LINF 1B e G3PD1, após otimização e análise de reprodutibilidade, uma duplex qPCR em sangue também foi padronizada. Para avaliação dos protocolos desenvolvidos foram utilizadas técnicas de estatística descritiva. Para análise comparativa com técnicas clássicas de diagnóstico da LV utilizou-se Teste Qui Quadrado de independência ou Teste Exato de Fisher (p<0,05 e p<0,01, respectivamente). Como resultados, após otimização, o limite de detecção alcançado pela qPCR em urina utilizando o protocolo de extração selecionado (kit comercial) foi de 5 fg/microlitros de amostra 0,034 parasitos) A duplex qPCR em sangue alcançou um limite de detecção de 2x102 fg/microlitros de amostra 1,4 (ou ~ 1,4 parasito), após a otimização. A partir dos dados estatísticos obtidos, pôde-se analisar alta concordância percentual entre a qPCR e urina e o conjunto de critérios diagnósticos (sorologia rK39 + qPCR em sangue), bem como entre a duplex qPCR em sangue e a qPCR em sangue, para os Grupos 01 (pacientes com suspeita de LV) e 02 (pacientes HIV positivos co-infectados ou não). Como um conjunto de critérios, os dois novos ensaios obtiveram excelentes concordâncias com o conjunto de técnicas clássicas: 88,89 por cento e 94,74 por cento para os Grupos 01 e 02, respectivamente. Não houve diferenças estatísticas significativas entre os testes. Pôde-se concluir que ambos os ensaios mostraram bom potencial para a incorporação, após validação, ao diagnóstico da LV; em conjunto ou individualmente (quando necessário), trazendo mais conforto, praticidade, confiabilidade e rapidez ao diagnóstico definitivo da patologia